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Diagnostic biologique de l’hypophosphatasie

I. Gennero1, 3 J.-P. Salles2, 3, *

1Service de biochimie, institut fédératif de biologie, hôpital Purpan, CHU de Toulouse, 31059 Toulouse Cedex 09, France

2Unité d’endocrinologie, maladies osseuses, génétique et gynécologie, hôpital des enfants, CHU de Toulouse, TSA 70034, 31059 Toulouse Cedex 09, France

3Centre de physiopathologie de Toulouse-Purpan, CPTP, INSERM UMR 1043, université de Toulouse-Paul-Sabatier, 31059 Toulouse, France

*Auteur correspondant. e-mail : salles.jp@chu-toulouse.fr (J. P. Salles)

Résumé

Le diagnostic biologique de l’hypophosphatasie (HPP) repose en premier lieu sur l’analyse précise de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) circulante sérique, mesurée par des méthodes biochimiques. Cette analyse nécessite des conditions précises de réalisation et d’interprétation et doit toujours être confrontée aux données cliniques et radiologiques. Le problème des normes d’ALP en fonction de l’âge, ainsi qu’un recouvrement possible avec les valeurs de sujets normaux en cas d’HPP, de même que les diagnostics différentiels des valeurs basses d’ALP en dehors de l’HPP sont discutés. La question de valeurs apparemment normales d’ALP dans des cas d’HPP prouvée est également discutée. La mesure d’un taux élevé de phosphate de pyridoxal, substrat de l’ALP, est utile pour conforter le diagnostic d’HPP.

© 2017 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Summary

Biological diagnosis of hypophosphatasia (HPP) is based in the first place, on precise analysis of the rate of circulating alkaline phosphatase (ALP) activity, measured by biochemical methods. This analysis requires specific conditions of realization and interpretation and should always be confronted with clinical and radiological data. Concerns regarding standard values of ALP levels with respect to age and of HPP ALP values overlapping with those of normal subjects will be discussed, as well as differential diagnoses which can be responsible for low values of ALP outside of HPP. The point of ALP values apparently normal in case of proved HPP will also be discussed. The finding of high level of pyridoxal phosphate, a substrate of APL, is useful to reinforce the diagnosis of HPP.

© 2017 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

1. Introduction

Les ALP sont un groupe d’enzymes glycoprotéiques, ancrées à la surface de la membrane, qui catalysent l’hydrolyse des phospho-esters en phosphate inorganique. Il existe quatre isoenzymes, trois spécifiques de tissu au niveau germinal, intestinal et placentaire et une quatrième non spécifique de tissu, ubiquitaire (Tissue-Nonspecific Alkalin Phosphatase [TNSALP]) codée par le gène Alkaline Phosphatase-Liver (ALPL) situé sur le chromosome 1, particulièrement exprimé dans l’os, le foie et le rein. L’HPP (Online Mendelian Inheritance in Man [OMIM] 146 300, 241 500, 241 510) est une maladie génétique rare potentiellement mortelle dans les formes les plus sévères [1,2]. Elle est causée par des mutations dans le gène ALPL, qui résultent en une faible activité de l’enzyme avec une accumulation de substrats non métabolisés. Le défaut d’activité de l’enzyme se traduit au niveau plasmatique avec une activité ALP diminuée. Les manifestations osseuses et dentaires de la maladie sont le plus souvent au premier plan, contribuant à un diagnostic clinique et radiologique probable. La confirmation génétique est habituellement obtenue (voir l’article d’E. Mornet) [3]. Le diagnostic biologique, qui repose sur l’analyse de l’activité circulante de l’ALP et de certains métabolites ou substrats de l’ALP, est une étape essentielle pour conforter le diagnostic, cependant son approche est complexe.

2. Diagnostic biologique

Le diagnostic repose, en premier lieu, sur des valeurs abaissées de l’activité de l’ALP sérique ou plasmatique. La méthode enzymatique utilisée pour doser cette activité repose sur une technique colorimétrique recommandée par l’International Federation for Clinical Chemistry (IFCC) qui mesure usuellement la vitesse d’hydrolyse du para-nitrophénylphosphate (PNPP) en para-nitrophénol en présence de Mg2+. L’hydrolyse à 37° C, déterminée par une mesure de densité optique (DO) à 410/480 nm du produit, reflète l’activité ALP exprimée en unités par litre (U/L) avec une gamme de référence dépendante de l’essai. Il faut noter que ce substrat n’est pas un substrat physiologique de l’enzyme et qu’il s’agit d’une mesure d’activité et non de quantité de l’enzyme. Le prélèvement doit être effectué sur un tube de sérum coagulé ou de plasma avec héparinelithium. Les substances anticoagulantes comportant des chélateurs d’ions sont proscrites, telles que l’éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) et l’oxalate, l’enzyme nécessitant le Mg2+ comme cofacteur. L’hémolyse altère également le dosage.

Même si les conditions de prélèvement et de l’analyse biochimique sont validées, l’interprétation d’un dosage d’ALP peut être complexe, surtout concernant les valeurs basses que l’on observe en cas d’HPP. Les valeurs d’ALP dépendent de l’âge et le sexe, généralement entre 150 et 300  U/L chez le nouveau-né. Elles sont ensuite variables, particulièrement en période pubertaire. Globalement il existe un recouvrement entre les valeurs observées en cas d’HPP prouvée génétiquement et celles de sujets de référence, même en tenant compte de l’âge et du sexe. Il est donc très important que le laboratoire fournisse des valeurs normales de l’enfant par tranche d’âge et de sexe pour éviter les erreurs de diagnostic [4]. Il est habituellement nécessaire de répéter le prélèvement dans des conditions cliniques standardisées. La période néonatale peut être particulièrement problématique [5]. Une analyse récente a montré que des valeurs d’ALP abaissées de manière répétée en l’absence de cause avérée, même en l’absence de symptômes cliniques, devaient faire réaliser des examens complémentaires radiologiques et génétiques dans l’hypothèse d’une HPP [4]. L’enquête familiale, le prélèvement des collatéraux, en dehors de la confirmation génétique d’une anomalie, sont des éléments importants. Bien qu’une certaine corrélation entre valeurs d’ALP et sévérité de la pathologie soit observée, il est difficile de donner des seuils de pathogénicité ou de sévérité [6]. Au sein d’une même famille il est possible d’observer des valeurs basses d’ALP chez des porteurs sains. L’anomalie génétique (souvent sous forme d’une mutation à effet dominant négatif) peut être présente mais peut s’exprimer cliniquement seulement chez certains membres de la famille. C’était le cas d’une famille dans laquelle nous avons observé des valeurs basses d’ALP chez plusieurs collatéraux alors que seulement deux sœurs avaient présenté des fractures importantes [7]. L’évaluation des taux d’ALP peut aussi être prise en défaut dans des formes particulières d’HPP avec valeurs normales d’ALP (pseudo-HPP). En fait des facteurs confondants ont pu être présents pour expliquer ce fait, tels qu’une phase de consolidation de fracture ou l’utilisation de normes inappropriées [1].

Il existe une isoforme osseuse de la TNSALP due à des modifications post-traductionnelles spécifiques à l’ostéoblaste qui peut être dosée par méthode immuno-quantitative (dosage couplé de l’activité), ou simplement immuno-spécifique. En réalité ces techniques pouvant également reconnaître jusqu’à 20 % de l’isoenzyme hépatique, elles sont peu utiles pour le diagnostic d’HPP.

Le phosphate de pyridoxal (PLP), forme circulante majeure de la vitamine B6 et substrat extracellulaire physiologique de l’ALP, est à ce jour le paramètre le plus contributif au diagnostic d’HPP, associé au dosage de l’ALP. La déphosphorylation du PLP par l’APL paraît être une étape nécessaire à la captation neuronale du pyridoxal, qui est ensuite à nouveau phosphorylé en PLP dans le milieu intracellulaire, où il joue un rôle de cofacteur pour de nombreuses réactions enzymatiques [8]. Il est aussi en cause dans certaines complications de l’HPP, notamment les convulsions pyridoxino-sensibles du nouveau-né dans les formes sévères par défaut de synthèse de neurotransmetteurs au niveau neuronal. Le prélèvement pour son dosage doit être fait à jeun sur plasma ou sérum et conservé à l’abri de la lumière. Ce dosage est réalisé par certains laboratoires spécialisés par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) suivie d’une détection fluorimétrique après dérivation [8]. Pour le diagnostic d’HPP, le dosage du PLP doit être réalisé sur le sérum ou le plasma et non au niveau de l’érythrocyte comme cela est fréquemment fait en pathologie nutritionnelle. Les normes sont propres à chaque laboratoire et le résultat peut être influencé par un état inflammatoire ou une variation de l’albuminémie. Des valeurs élevées de PLP, en l’absence de supplémentation en vitamine B6, sont très contributives au diagnostic d’HPP. Sensible et spécifique, ce dosage est généralement corrélé à la sévérité de la pathologie [1]. Les valeurs d’ALP et de PLP sont aussi habituellement bien corrélées [9]. Des valeurs basses d’ALP et hautes de PLP sont également observées dans l’odonto-hypophosphatasie, forme d’HPP d’expression exclusivement odontologique [1].

La phospho-éthanolamine (PEA) est un autre substrat potentiel de l’ALP dont le dosage n’est pas de pratique courante, réservé à l’activité de recherche. Elle est habituellement dosée dans les urines par chromatographie échangeuse d’ions après déprotéinisation et dérivation à la ninhydrine. Les aléas liés au recueil d’urine, la faible disponibilité de la méthode et la rareté des normes publiées rendent son usage peu contributif au diagnostic d’HPP [10]. Il en est de même du pyrophosphate inorganique, autre substrat physiologique de l’ALP impliqué dans la physiopathologie par son effet inhibiteur sur la minéralisation, dont le dosage est actuellement réservé à la recherche.

L’HPP peut se caractériser chez l’enfant par un rachitisme à taux élevés de calcium et phosphate sériques. Le bilan phosphocalcique est donc un élément complémentaire important du diagnostic, surtout chez le nourrisson et dans les formes néonatales sévères. Le défaut de minéralisation dû au déficit d’activité ostéoblastique de l’ALP empêche la fixation normale du calcium et du phosphore dans l’hydroxyapatite. On observe donc chez le jeune enfant une tendance à l’hypercalcémie et à l’hyperphosphatémie, accompagnées d’une hypercalciurie et d’une freination de la sécrétion de parathormone (PTH). Aux valeurs basses de PTH sont habituellement associées des valeurs de 25-OH vitamine D plutôt élevées par défaut d’hydroxylation en 1-25 OH2 vitamine D. Cette situation se normalise habituellement après quelques années de vie sauf si un apport nutritionnel excessif en calcium est maintenu. Il est rare de rencontrer une hypercalcémie chez le grand enfant ou chez l’adulte. Au total, des valeurs basses d’ALP à répétition, après élimination des diagnostics différentiels, associées à des valeurs élevées de PLP, avec éventuellement un bilan phosphocalcique évocateur, doivent conduire à l’analyse génétique et quoi qu’il en soit faire envisager le diagnostic d’HPP.

3. Diagnostic différentiel des valeurs basses d’ALP

Des valeurs basses d’ALP peuvent se rencontrer dans différentes conditions pathologiques qu’il convient d’identifier ou d’éliminer avant de progresser dans le diagnostic d’HPP (Tableau I). Le déficit en zinc ou en magnésium doit être apprécié s’il est envisageable. L’hypothyroïdie et l’hypoparathyroïdie contribuent également à diminuer le taux d’ALP. Une évaluation générale des fonctions métaboliques, en particulier hématologique, hépatique et rénale, est également nécessaire. Des conditions particulières telles que la maladie de Wilson, l’intoxication à la vitamine D, le déficit en vitamine C, le syndrome de Cushing ou d’autres situations rares doivent être identifiées. Au-delà d’un certain nombre de situations détectables qui sont détaillées par ailleurs, il faut insister sur toutes les situations ayant un impact nutritionnel important, en particulier la maladie cœliaque dont les symptômes peuvent être similaires à ceux de l’HPP [1]. De même les traitements prolongés de la résorption osseuse (notamment par bisphosphonates) abaissent le taux d’ALP.

Deux  situations doivent également être discutées. En période néonatale, l’interprétation des valeurs d’ALP peut être difficile. Des éléments confondants peuvent être présents notamment en cas de prématurité (ostéopénie du prématuré). Tout élément qui contribue à diminuer significativement la masse osseuse du nouveau-né peut contribuer à abaisser les valeurs d’ALP. C’est le cas de l’ostéogenèse imparfaite (OI) sévère. Le dosage du PLP et l’analyse précise du bilan phosphocalcique sont des éléments d’appoint, particulièrement lorsqu’il existe une tendance à l’hypercalcémie et à l’hyperphosphatémie avec PTH freinée. Des anomalies anténatales ou postnatales précoces peuvent être présentes mais les critères radiologiques francs d’HPP ne le sont pas toujours. Ces situations peuvent conduire à des diagnostics erronés, en faveur ou en défaveur de l’HPP. Ceci est d’autant plus important que, au moment où des décisions thérapeutiques sont à prendre, elles peuvent conduire à des décisions opposées : traitement d’une OI ou traitement d’une HPP. Par ailleurs, la dysplasie cléidocrânienne, qui a pour conséquence un défaut massif de minéralisation du crâne, possède un profil biologique d’HPP, y compris sur le bilan phosphocalcique, mais le diagnostic est habituellement réalisé par la radiologie [11].

Causes d’hypophosphatasémie

Enfin, si des diagnostics erronés d’HPP peuvent être portés, surtout chez l’adulte, par méconnaissance du diagnostic différentiel, celuici peut aussi être méconnu en raison de facteurs confondants. C’est le cas de la puberté au cours de laquelle les valeurs d’ALP s’élèvent, même chez les sujets atteints d’HPP, ce qui entraîne un recouvrement possible avec les valeurs observées chez les sujets sains [4,7]. Ceci peut de plus être aggravé par l’élévation des valeurs d’ALP en phase de consolidation de fractures. En outre les cliniciens et biologistes sont plus accoutumés à réagir aux valeurs élevées d’ALP qu’aux valeurs basses. Des normes pour le dosage de l’ALP en pédiatrie ont été récemment publiées qui peuvent servir de repère pour des dosages standardisés ou automatisés [12]. Dans tous les cas l’analyse des valeurs de PLP et le retour précis aux données cliniques et radiologiques ainsi que le recours éventuel à l’analyse génétique sont essentiels.

4. Conclusion

L’étape biologique est un élément clé du diagnostic d’HPP qui repose fondamentalement sur des taux bas d’ALP documentés dans de bonnes conditions et répétés. Les éléments d’apport essentiel sont le dosage du PLP et l’analyse du bilan phosphocalcique. Les éléments du diagnostic différentiel de taux bas d’ALP doivent être connus. La confrontation avec les données cliniques et radiologiques, l’enquête familiale et l’analyse génétique sont des compléments essentiels. L’étape biologique d’évaluation de l’ALP et des autres paramètres biochimiques est essentielle pour ne pas retarder le diagnostic des formes sévères néonatales ou infantiles dont le pronostic dépend d’une prise en charge spécifique rapide. Elle est aussi fondamentale pour discuter le diagnostic différentiel et les autres causes d’hypophosphatasémie, beaucoup plus fréquentes, et ne pas aboutir à des erreurs.

Liens d’intérêts

Jean-Pierre Salles a reçu des honoraires d’Alexion Pharmaceuticals pour des interventions et expertises ponctuelles et a été ou est investigateur principal ou investigateur d’études promues par le laboratoire.

Références

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[2] Salles JP. Clinical Forms and Animal Models of Hypophosphatasia. Subcell Biochem 2015;76:3-24.

[3] Taillandier A, Domingues C, De Cazanove C, Monnot S, Kiffer-Moreira T, Rothenbuhler A, et al. Molecular diagnosis of hypophosphatasia and differential diagnosis by targeted Next Generation Sequencing. Mol Genet Metab 2015; 116:215-20.

[4] Saraff V, Narayanan VK, Lawson AJ, Shaw NJ, Preece MA, Högler W. A Diagnostic Algorithm for Children with Low Alkaline Phosphatase Activities: Lessons Learned from Laboratory Screening for Hypophosphatasia. J Pediatr 2015;172:181-6.

[5] Tinnion RJ, Embleton ND. How to use… alkaline phosphatase in neonatology. Arch Dis Child – Educ Pract 2012;97:157-63.

[6] Linglart A, Biosse-Duplan M. Hypophosphatasia. Curr Osteoporos Rep 2016;14(3):95-105.

[7] Moulin P, Vaysse F, Bieth E, Mornet E, Gennero I, DalicieuxLaurencin S, et al. Hypophosphatasia may lead to bone fragility: don’t miss it. Eur J Pediatr 2009;168:783-8.

[8] Ueland PM, Ulvik A, Rios-Avila L, Midttun Ø, Gregory JF. Direct and Functional Biomarkers of Vitamin B6 Status. Annu Rev Nutr 2015;35:33-70.

[9] Riancho-Zarrabeitia L, García-Unzueta M, Tenorio JA, GómezGerique JA, Ruiz Pérez VL, Heath KE, et al. Clinical, biochemical and genetic spectrum of low alkaline phosphatase levels in adults. Eur J Intern Med 2016;29:40-5.

[10] Imbard A, Alberti C, Armoogum-Boizeau P, Ottolenghi C, Josserand E, Rigal O, et al. Phosphoethanolamine normal range in pediatric urines for hypophosphatasia screening. Clin Chem Lab Med 2012;50:2231-3.

[11] Unger S, Mornet E, Mundlos S, Blaser S, Cole DE. Severe cleidocranial dysplasia can mimic hypophosphatasia. Eur J Pediatr 2002;161:623-6.

[12] Estey MP, Cohen AH, Colantonio DA, Chan MK, Marvasti TB, Randell E, et al. CLSI-based transference of the CALIPER database of pediatric reference intervals from Abbott to Beckman, Ortho, Roche and Siemens Clinical Chemistry Assays: Direct validation using reference samples from the CALIPER cohort. Clin Biochem 2013;46:1197-1219.

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